Известно, что наиболее дешевым способом произ­водства продукта “аминокислота” является кислотный гидролиз ке­ратинсодержащего сырья (рога, копыта, шерсть, щети­на, перо и т.п.) с последующей нейтрализацией рас­твора на анионите.

Хотя кислотный гидролиз кератина изучен доста­точно хорошо [1-4], химическая очистка аминокис­лот далека от оптимизации.

В настоящей работе сделана попытка получить оп­тимальные условия нейтрализации и ионообменной сорбции аминокислотной смеси расчетным путем. Основная трудность подобной задачи состоит в том, что кроме специфики отдельных ионообменных рав­новесий, например, влияния дисперсионных сил, не­обменной сорбции и т.д., многоионный обмен имеет свои особенности.

Главным при расчете сорбции ионов из многоком­понентной смеси является допущение о независимо­сти констант парного обмена от присутствия в раство­ре других ионов. В ряде работ [5 – 7] на примере обме­на в 3-4-х компонентных системах, содержащих К+, Na+, NH4+, Са2+, А13_, Fe2+, этот эффект не наблюдался. Другие авторы [8 – 10], исследовавшие статическое обменное равновесие в системах Mg2+-K+-H+; NH4+-K+-H+; Ca2+-NH4+-H+ показывают существен­ную зависимость константы обмена двух ионов от за­полнения ионита третьим ионом.

Известно, что зависимость коэффициента избирате­льности ионов от заполнения ионита проявляется в том случае, когда доля иона в ионите составляет более 15-20%. Естественно предположить, что при нали­чии в системе 17 аминокислот, ионов водорода и ам­мония доля иона даже с самым высоким коэффициен­том избирательности не может быть более 15%. Таким образом, допущение о независимости парного обмена от заполнения ионита может быть справедливым.

Были приняты также еще два допущения:

– коэффициенты избирательности сорбции ионов слабо зависят от концентрации их в растворе и ионите;

– полная статическая обменная емкость катионита одинакова для каждого из участвующих в обмене ионов.

Экспериментальная часть

При расчете концентрации аминокислоты в катио­ните учитывалась диссоциация аминокислоты в зави­симости от pH раствора. Эта зависимость выражается в общем случае функцией f(W) [рис. 11, 12]:

где Сн — концентрация ионов водорода в растворе, Кь К2, К, — константы диссоциации аминокислоты в рас­творе.

Концентрация ионной формы аминокислоты, соот­ветствующей данной концентрации водорода в раство­ре, будет:

для иона с максимальным положительным зарядом 7•^тах-

для иона с зарядом Zmax _,:

где Сам — аналитическая концентрация аминокислот в растворе.

Концентрация ионов аммония в растворе также за­висит от pH. Ее можно определить по уравнению:

Концентрацию ионов аммония, водорода и амино­кислот в фазе катионита можно выразить:

где концентрация аммония в смоле; gH

концентрация иона водорода в смоле; 8 н = сн’

где: g 2+ — концентрация 2-х зарядного иона аминокислоты;

где: g + — концентрация однозарядного иона аминокислоты в ионите.

Уравнение материального баланса для фазы ионита имеет вид:

S0=gH++XsaM++ZgaM2++’gNHr

Его можно выразить также как сумму сорбции од­нозарядных и двухзарядных ионов: 

So =ZSi2+ +Икр

или

где: g0 — полная статическая обменная емкость иони­та, (2>с), — сумма произведений коэффициентов избирательности однозарядных ионов на их концент­рацию в растворе; (5>с)2 — сумма произведений коэффициентов избирательности двухзарядных катио­нов на их концентрацию в растворе; gH/CH — отноше­ние концентрации водородных ионов в смоле к их кон­центрации в растворе.

Уравнение (11) можно выразить в форме квадратно­го уравнения:

Решение этого  уравнения имеет следующий вид:

Обозначая выражение 

через e, получаем

Уравнение (14) позволяет получить значение gH/CH, необходимое для расчета сорбции двухзарядных и од­нозарядных катионов на катионите.

Материалы и методы

Аналитические концентрации аминокислот были определены методом хроматографии на аминоанали- заторе LC-5001 фирмы “Биотроникс” (Германия). Кон­центрацию аммиака в гидролизате определили мето­дом Кьельдаля.

Кислотный гидролизат нейтрализовали на колонке со смолой ЭДЕ-10п в ОН~форме до pH 1, 2, 4 и 7. Со­ответственно концентрация водородных ионов в рас­творе составила 10-1, 10~2, 10~4и 10~7 моль/л.

Коэффициенты избирательности аминокислот были заимствованы из некоторых работ [11, 12] и уточнены по методикам, изложенным в работе [12].

Коэффициенты избирательности двухзарядных ка­тионов аминокислот (лизина, аргинина, гистидина) получали из уравнения изотермы:

где: g 2+ — концентрация двухзарядного катиона в ионите (мг • экв/гсм), g0 — полная статическая обменная емкость катионита (КУ2 х 8) (мг • экв/гсм), Кц — коэффициент избирательности сорбции двухзаряд­ного катиона аминокислоты на водородной форме ка­тионита.

Ст — аналитическая концентрация аминокислоты в растворе (моль/л).

Коэффициент избирательности однозарядных ионов двухосновных аминокислот получали из анали­за обмена в тройной системе аминокислота — Na+-H+ при pH раствора 7. В этих условиях концентрация од­нозарядного иона полностью соответствует аналити­ческой концентрации аминокислоты: Сам + =Сам.

Расчетное уравнение имело вид:

При расчете коэффициентов избирательности мо- ноаминокарбоновых аминокислот Сам+ для уравнения (16) находили по уравнению (3).

Статическое обменное равновесие исследовали в растворах с концентрацией аминокислоты от 0,002 до 0,5 моль/л, соляной кислоты — от 0,0004 до

1.2 моль/л, хлористого натрия — от 0,05 до

1.3 моль/л.

Опыты проводили при температуре 20 °С ± 0,5 в ко­нических стеклянных колбах емкостью 1 л с притер­тыми пробками. Соотношение объемов раствора и на­бухшего катионита составляло 200 – 500, в результате чего перенос растворителя при обмене ионов не влиял на объем раствора.

Равновесие достигалось через 48 ч, после чего ионит отделяли от равновесного раствора с помощью фильтрования и центрифугирования в течение 15 мин при 4500 об/мин.

Концентрацию аминокислоты в фазе ионита опреде­ляли после ее элюции со смолы 2н. NaOH и нейтрали­зации элюата кислотой, путем формольного потенцио­метрического титрования по стандартным растворам.

Константы определяли в трех независимых сериях ионообменных равновесий.

Результаты определения коэффициентов избирате­льности двухзарядных и однозарядных катионов ами­нокислот представлены в таблице. Кроме того в табли­це указаны аналитические концентрации аминокисло­ты в 1 % растворе осветленного нейтрального гидролизата.

На основании данных таблицы были произведены расчеты величин сорбции каждой аминокислоты при концентрации в растворе водородных ионов, соответ­ствующих pH 1,2, 4, 7, а также расчетные концентра­ции в смоле ионов NH4+.

Результаты этих расчетов показывают, что по мере уменьшения концентрации в растворе водородных ионов (увеличение pH) доля сорбции аммония возрас­тает. Зависимость доли аминокислот в смоле возраста­ет с максимумом при pH 2, затем падает.

Для выяснения правильности расчетного метода и диапазона его применения расчетные данные были сравнены с экспериментальными.

Для опытов использовали стеклянную колонку 25 х 300 мм емкостью 150 мм смолы. В качестве смо­лы брали отрегенерированный и промытый сульфо- стирольный катионит КУ2 х 8 в Н+-форме с полной обменной емкостью 5,0 мг • экв/г.

Осветленный стандартный раствор гидролизата ке­ратина, содержащий 10 % аминокислот, и аммиак в концентрации 0,25 моль/л пропускали в количестве пять объемов на объем смолы через колонку с данным катионитом со скоростью 80-90мл/ч. Степень ней­трализации гидролизата на анионите соответствовала pH 1, 2, 4 и 7. Гидролизат вытесняли с колонны водой с той же скоростью и промывали пятью объемами дис­тиллированной воды. Для анализа в каждом случае брали 10 мл смолы, насыщенной аминокислотами, и высушивали ее в вакуум-сушильном шкафу при тем­пературе 95 °С и вакууме 0,9 атм. Сухую смолу (2 г) обрабатывали 100 мл 1н. NaOH в течение 30 мин. В элюате определяли по микрометоду Кьельдаля аммиак и количество аминокислот (в сумме) методом формо- льного титрования. Из полученных данных определя­ли сорбцию в ионите аминокислот и аммиака, а также соотношения между ними.

Сопоставление полученных экспериментальных данных с расчетными представлено на рис. 1 и 2.

Анализируя кривые сорбции аминокислот на рис. 1, можно заметить, что расхождение экспериментальных и расчетных данных, вполне удовлетворительное при pH 1 и 2, становится очень значительным при значе­нии pH в диапазоне 4-7.

 Это объясняется тем, что при увеличении pH от 4 до 7 в растворе нарастает количество нейтрального цвиттер-иона (исключение составляют 2-х зарядные аминокислоты).

В этом случае преобладает следующий механизм сорбции аминокислот:

Указанный механизм нельзя назвать ионообмен­ным, в то время как именно ионный обмен лежит в основе использованного расчетного метода.

Величина сорбции аминокислот при pH 7 заметно превышает расчетное значение. Однако при низких значениях pH раствора (1 -2), где в основном присут­ствуют катионы аминокислот, расхождение экспери­ментальных и расчетных данных составляет не более 10 % от величины сорбции.

Расчетная (3) и экспериментальная (4) кривые сор­бции аммония также имеют расхождения в области pH 3-7. Так при pH 7 расчетная величина сорбции прак­тически вдвое превышает экспериментальное значение.

Причина заключается в том, что расчетный метод учитывает только катионы аминокислот и не учитыва­ет присутствие цвиттер-ионов, создающих конкурен­цию ионам аммония.

Характер кривых, изображенных на рис. 2, подтвер­ждает изложенное выше. Расчетная доля аминокислот в смоле достигает максимума при pH 2, а затем падает. Экспериментально же найденная доля аминокислот

возрастает, достигая максимума при pH 4, а затем не­значительно снижается.

Анализ кривых 3 и 4 показывает, что соответствие экспериментальных и расчетных данных отношения доли аммония к доле аминокислот наблюдается лишь при pH 1 – 2.

Судя по экспериментальной кривой 4 при повыше­нии pH раствора от 1 до 7 это отношение повышается почти в 3 раза.

Приведенный анализ позволяет сделать важные для технологической практики выводы: 1. Предложенный расчетный метод можно применять при значения pH раствора 1-2. 2. При нейтрализации гидролизата до значения pH от 1 до 2 величина сорбции аминокислот находится на высоком уровне при минимальном коли­честве аммиака в смоле.

Тем не менее, главный вывод данной работы заклю­чается в том, что предлагаемый расчетный метод по­зволяет в диапазоне pH от 0 до 3, т.е. в кислой области сделать предварительную оценку величины сорбции на катионите одной или нескольких аминокислот из любой многокомпонентной смеси, включающей поми­мо аминокислот различные одно — и двухвалентные катионы. Таким образом разработан универсальный расчетный метод, который с достаточно хорошей точ­ностью позволяет предварительно оценивать отноше­ние ионов в катионите по их аналитическим концент­рациям в растворе.

ЛИТЕРАТУРА

1. А. В. Бертудина, А. Д. Неклюдов, П-ая Всероссийская кон­ференция “Прогрессивные экологически безопасные техно­логии хранения и переработки сельхозпродукции для созда­ния продуктов питания повышенной пищевой и биологиче­ской активности ”, Углич (1996), с. 48.

2. А. В. Бертудина, А. Д. Неклюдов, Ш-я Международная на­учно-техническая конф. “Пища, экология, человек”, Москва (1999), с. 55.

3. А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин, Мясная индустрия, 3(6), 42-43(1998).

4. П. С. Васильев, Актуальные вопросы парентерального пи­тания, Зинатне, Рига (1972), сс. 12 – 13.

5. Б. П. Никольский, В. И. Парамонова, Успехи химии, 8, 1535 – 1538 (1939).

6. А. Т. Давыдов, И. Л. Левицкий, Труды хим. факультета и НИИ химии Харьковского университета, вып.12, Харьков, (1954), сс. 309-312.

7. К. М. Салдадзе, А. Б. Пашков, В. С. Титов, Ионообменные высокомолекулярные соединения, Госхимиздат, Москва, (1960), с. 37.

8. В. С. Солдатов, Л. В. Новицкая, в кн.: Термодинамика ион­ного обмена, Наука и техника, Минск (1968), сс. 217 – 223.

9. В. С. Солдатов, О. Ф. Харевич, в кн.: Термодинамика ион­ного обмена, Наука и техника, Минск (1968), сс. 228 – 233.

10. В. П. Кольненков, Дисс. на соиск. канд. хим. наук, Минск, (1972), сс. 91 -95.

11. Т. Kawakita, Т. Ogura, Agriculture and Biol. Chemistry, Japan, 54(1), 1 -8 (1990).

12. Э. M. Тер-Саркисян, Д. С. Кутуков, Хим.-фарм. журн., 12(4), 83-87(1978).

Одним из важнейших компонентов БАД является наличие в них высокоочищенных аминокислот.
Э.М.Тер-Саркисян

Д-р техн. наук Ю.А.ТЫРСИН, канд. хим. наук Э.М.ТЕР-САРКИСЯН, Н.Н КИСИЛЬ

Московский государственный университет пищевых производств

(Представлена член-кор. РАСХН В.И.Тужилкиным)

Пищевые биологически активные добавки (БАД) все больше завоевывают мировой рынок. Так, в США в настоящее время не менее 70 % населения использует их в ежедневных пищевых рационах, повышая сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды. В России также проявляется интерес к БАД, чему немало способствуют российские дистрибьюторы продукции американских фирм.

Одним из важнейших компонентов БАД являются высокоочищенные аминокислоты, промышленное производство которых в России пока не налажено.

Как видно из анализа литературы, самым дешевым способом производства аминокислот является гидролиз различных белков. Из много¬численных методов гидролиза — высокого давления, глубокого охлаждения, ферментативного, химического (щелочного или кислотного) — первые два дают гидролизат, состоящий преимущественно из пептидов [6]. Ферментативный гидролиз протекает в мягких условиях, но даже при последовательном использовании нескольких ферментов в лучшем случае получают гидролизат с содержанием 25—30 % свободных аминокислот.

Для получения смеси свободных аминокислот используют кислотный гидролиз, чаше всего с помощью таких кислот, как серная и соляная. 

Недостатком этого метода является то, что в процессе гидролиза белка сильной кислотой в жестких условиях происходит деструкция аминокислот, сопровождающаяся образованием аммиака и других побочных продуктов [4].

Кроме того, гидролизат содержит значительное количество полигетероциклических соединений – продуктов поликонденсации аминокислот друг с другом и с другими побочными продуктами, благодаря чему гидролизат имеет темный цвет и специфический запах.

Несмотря на полное разрушение триптофана и частичное разрушение некоторых, особенно русодержащих, аминокислот гидролиз белка сильными кислотами обеспечивает наиболее полное и глубокое расщепление белка с образованием свободных аминокислот в количестве 50— 85 %.

Для получения свободных аминокислот высокой очистки с минимальной себестоимостью к сырью предъявлялись следующие требования:

— источник белка должен быть доступным и дешевым;

— он должен содержать максимальное количество белка и минимальное количество примесей;

— гидролизующий агент должен обеспечить максимально возможный полный гидролиз белка при минимальной температуре и за минимальное время.

Предъявляемым требованиям более всего отвечает рого-копытное сырье и серная и соляная кислоты.

Поэтому в качестве субстрата была выбрана диспергированная рого-копытная мука. Она со-держит не менее 90 % кератина, 2-3 % солей и не более 4 % жира.

Кислотный гидролиз осуществляли при соотно-шении сырье:2-6 н минеральная кислота 1:2 при температуре ПО, 130 °С в течение от 4 до 6 ч.

В качестве критерия глубины гидролиза брали содержание аминного азота, которое определяли методом формального титрования.

Предварительный анализ данных показал боль¬шое различие в свойствах гидролизатов, полученных при температурах 110 °С и 130 °С. Поэтому представлялось целесообразным продолжить про¬цесс при 130°С.

На рисунке представлены данные по гидролизу кератина серной и соляной кислотами в концентрации 2, 4, 6 н.

 Зависимость показатели аминного азота при гидролизе рого- копытного сырья растворами минеральных кислот .от времени процесса:

Из рисунка видно, что гидролиз соляной кислотой идет значительно интенсивнее. С одной стороны это, безусловно, определяется ее более сильной степенью диссоциации по сравнению с серной, с другой, ее более низкой сольватацией.

Из анализа графических данных следуют два вывода.

Очень близки по эффективности гидролиза 2 н НС1 и 4 н H2S04, а также 4 н НС1 и 6 н H2S04; видно, что самую низкую степень расщепления белка дает 2 н H2S04, а самую высокую – 6 н НС1. Второй вывод состоит в том, что после 4 ч гидролиза аминный азот изменяется незначительно и к 6 часам начинает снижаться.

Результаты анализа данных кислотного гидролиза кератина приведены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что количество растворенного белка увеличивается с переходом от серной кислоты к соляной. В то же время заметно значительное увеличение показателя аминного азота,

 который коррелируется с содержанием сво­бодных аминокислот в растворе.

Что касается содержания аммиачного азота, который можно связать с термической деструкци­ей аминокислот, то оно значительно ниже в слу­чае солянокислого гидролиза. Это имеет значе­ние при дальнейшей ионообменной очистке ами­нокислот, где NH4+ выступает главным конку­рентом.

Время повышения концентрации НС1 от 4 до 6 н и увеличение продолжительности гидролиза не­значительно сказывается на этом показателе. Вместе с тем, одновременно с повышением кон­центрации НС1 повышается степень декструкции аминокислот, которая коррелируется с содержа­нием аминного азота в гидролизате.

Процесс получения высокоочищенной смеси аминокислот включает следующие стадии:

– нейтрализацию гидролизата на анионите ЭДЭ-10п в ОН’ форме;

– сорбцию свободных аминокислот на катио­ните КУ2х8 в Н+ форме;

– элюцию аминокислот с катионита раствором щелочи.

Результаты процесса нейтрализации кислотно­го гидролиза демонстрирует табл. 2.

Объем кислотного гидролизата, показанный в табл. 2, взят из расчета объема смолы в колонне и ее динамической обменной емкости. Показа­тель pH полученного нейтрализованного гидро­лизата соответствует расчетным данным.

Отношение аминного азота к аммиачному уменьшается в случае аминокислотного гидроли­за, что свидетельствует о более высокой степени деструкции. При сернокислотном гидролизе это соотношение увеличивается, т.е. наблюдается более выгодное для сорбции аминокслот соотно­шение между аминным азотом, соответствующим концентрации аминокислот в растворе, и конку­рирующим с ним в процессе сорбции аммонием. Полученные нейтральные растворы гидролизатов анализировали на содержание свободных амино­кислот на аминоанализаторе LC-5001 фирмы «Биотроникс» (Германия) по стандартной про­грамме [1, 2].

Результаты анализа приведены в табл. 3.

Из полученных данных видно, что H2S04 и НС1 по-разному гидролизуют белок. Общее ко­личество свободных аминокислот при увеличе­нии концентрации кислоты возрастает. В случае с 4 н НС1 также наблюдается незначительное уменьшение общего количества аминокислот с увеличением продолжительности гидролиза.

При гидролизе с помощью серной кислоты до­стигается более высокое содержание аспарагино­вой кислоты, глицина, аланина.

При солянокислотном гидролизе эти показате­ли уменьшаются. Однако количество других ами­нокислот, таких как цистин, валин, метионин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, ли­зин, аргинин, пролин, увеличивается. Особен­но это относится к метионину, цистину, валину, аргинину, лизину.

Таким образом, более сбалансированную смесь аминокислот дает гидролиз с помощью 6 н НС1 при 130 °С.

Данный состав практически не изменяется от 4 до 6 ч, но при этом можно заметить незначитель­ное понижение концентрации отдельных амино­кислот к 6-ти часам.

Учитывая все эти факторы, можно допустить, что время проведения гидролиза в течение 5 ч оп­тимально.

По нашему мнению, представляло интерес оценить количественное соотношение суммы свободных аминокислот и пептидной фракции. Для этого был использован упрощенный метод оценки: нейтральный гидролизат пропускали че­рез колонну с катионитом КУ2х8 в Н+ форме и в фильтрате определяли сухой остаток (СВ) в г/л и аминный азот (NNH ) в г/л.

При определении среднего количества амино­кислотных звеньев в пептиде нами были приня­ты две условные величины:

— средний грамм-эквивалент аминокислоты, полученный отношением суммы их молекуляр­ных масс к их количеству. Он составляет 130;

— количество грамм-эквивалентов аминокислот

 В том случае, если бы количество сухого ос­татка (СВ) соответствовало только сумме свобод­ных аминокислот, а грамм-эквивалент аминного азота соответствовал количеству грамм-эквива­лентов аминокислот в фильтрате, то получилось бы соотношение

Истинное соотношение этих величин, отлич­ное от 1, должно показать количество аминокис­лотных звеньев, связанных вместе в пептиде, т.е. полноту гидролиза.

Результаты расчетов и показатели сорбции аминокислот приведены в табл. 4.

 Литература

1. Астаурова ОБ., Мыслова Н.Л., Тимохина Е.А., Беларева А.В., Капитова О Н. // Прикладная биохимия и микробиоло­
гия. 1991. Т. 27. № 5, с. 14-15.

2. Berdutina А. V. et al. Study of the process of acid hydrolysis of keratin-containing raw materials as a method for manutature of food additives. //Cong. proc. 43-rd YCOMST. 1997. 27 July – 1 Aug. 1997. Oakland. New Zealand, pp. 482—483.

3. Ivankin A.N., Nekludov A.D., Mosma G. Y Utilization of wheat wastes by hydrolytic method for production of biologically active substances for food. Medical and microbiological purposes // Cong. proc. 43-rd YCOMST. 1997. 27 July – 1 Aug. 1997. Oakland. New Zealand, pp. 500—501.

4. Иванкин А Н. Биологически активные вещества из жировой ткани. Автореф. дисс…д-ра хим. наук. М., 1998.

5. Неклюдов А.Д., Иванкин А Н., Баер НА., Бердутина А.В., Дубина В.И. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. № 3, с. 24-25.

6. Неклюдов А.Д., Новашин С.М. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. № 9, с. 24-25.

7. Опытко Л.Ф., Остенникова З.П., Ильюхина.Е.А. // Фарма­ция. 1997. Т. 26. № 6.

8. Тимохина Е.А.. Люблинская Л.А., Бойцова С.Е. // Приклад­ная биохимия и микробиология. 1987. № 23, с. 426-428.