Влияние режимов кислотного гидролиза кератина на эффективность выделения очищенных аминокислот
Одним из важнейших компонентов БАД является наличие в них высокоочищенных аминокислот.
Э.М.Тер-Саркисян
Д-р техн. наук Ю.А.ТЫРСИН, канд. хим. наук Э.М.ТЕР-САРКИСЯН, Н.Н КИСИЛЬ
Московский государственный университет пищевых производств
(Представлена член-кор. РАСХН В.И.Тужилкиным)
Пищевые биологически активные добавки (БАД) все больше завоевывают мировой рынок. Так, в США в настоящее время не менее 70 % населения использует их в ежедневных пищевых рационах, повышая сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам окружающей среды. В России также проявляется интерес к БАД, чему немало способствуют российские дистрибьюторы продукции американских фирм.
Одним из важнейших компонентов БАД являются высокоочищенные аминокислоты, промышленное производство которых в России пока не налажено.
Как видно из анализа литературы, самым дешевым способом производства аминокислот является гидролиз различных белков. Из много¬численных методов гидролиза — высокого давления, глубокого охлаждения, ферментативного, химического (щелочного или кислотного) — первые два дают гидролизат, состоящий преимущественно из пептидов [6]. Ферментативный гидролиз протекает в мягких условиях, но даже при последовательном использовании нескольких ферментов в лучшем случае получают гидролизат с содержанием 25—30 % свободных аминокислот.
Для получения смеси свободных аминокислот используют кислотный гидролиз, чаше всего с помощью таких кислот, как серная и соляная.
Недостатком этого метода является то, что в процессе гидролиза белка сильной кислотой в жестких условиях происходит деструкция аминокислот, сопровождающаяся образованием аммиака и других побочных продуктов [4].
Кроме того, гидролизат содержит значительное количество полигетероциклических соединений – продуктов поликонденсации аминокислот друг с другом и с другими побочными продуктами, благодаря чему гидролизат имеет темный цвет и специфический запах.
Несмотря на полное разрушение триптофана и частичное разрушение некоторых, особенно русодержащих, аминокислот гидролиз белка сильными кислотами обеспечивает наиболее полное и глубокое расщепление белка с образованием свободных аминокислот в количестве 50— 85 %.
Для получения свободных аминокислот высокой очистки с минимальной себестоимостью к сырью предъявлялись следующие требования:
— источник белка должен быть доступным и дешевым;
— он должен содержать максимальное количество белка и минимальное количество примесей;
— гидролизующий агент должен обеспечить максимально возможный полный гидролиз белка при минимальной температуре и за минимальное время.
Предъявляемым требованиям более всего отвечает рого-копытное сырье и серная и соляная кислоты.
Поэтому в качестве субстрата была выбрана диспергированная рого-копытная мука. Она со-держит не менее 90 % кератина, 2-3 % солей и не более 4 % жира.
Кислотный гидролиз осуществляли при соотно-шении сырье:2-6 н минеральная кислота 1:2 при температуре ПО, 130 °С в течение от 4 до 6 ч.
В качестве критерия глубины гидролиза брали содержание аминного азота, которое определяли методом формального титрования.
Предварительный анализ данных показал боль¬шое различие в свойствах гидролизатов, полученных при температурах 110 °С и 130 °С. Поэтому представлялось целесообразным продолжить про¬цесс при 130°С.
На рисунке представлены данные по гидролизу кератина серной и соляной кислотами в концентрации 2, 4, 6 н.
Зависимость показатели аминного азота при гидролизе рого- копытного сырья растворами минеральных кислот .от времени процесса:
Из рисунка видно, что гидролиз соляной кислотой идет значительно интенсивнее. С одной стороны это, безусловно, определяется ее более сильной степенью диссоциации по сравнению с серной, с другой, ее более низкой сольватацией.
Из анализа графических данных следуют два вывода.
Очень близки по эффективности гидролиза 2 н НС1 и 4 н H2S04, а также 4 н НС1 и 6 н H2S04; видно, что самую низкую степень расщепления белка дает 2 н H2S04, а самую высокую – 6 н НС1. Второй вывод состоит в том, что после 4 ч гидролиза аминный азот изменяется незначительно и к 6 часам начинает снижаться.
Результаты анализа данных кислотного гидролиза кератина приведены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что количество растворенного белка увеличивается с переходом от серной кислоты к соляной. В то же время заметно значительное увеличение показателя аминного азота,
который коррелируется с содержанием свободных аминокислот в растворе.
Что касается содержания аммиачного азота, который можно связать с термической деструкцией аминокислот, то оно значительно ниже в случае солянокислого гидролиза. Это имеет значение при дальнейшей ионообменной очистке аминокислот, где NH4+ выступает главным конкурентом.
Время повышения концентрации НС1 от 4 до 6 н и увеличение продолжительности гидролиза незначительно сказывается на этом показателе. Вместе с тем, одновременно с повышением концентрации НС1 повышается степень декструкции аминокислот, которая коррелируется с содержанием аминного азота в гидролизате.
Процесс получения высокоочищенной смеси аминокислот включает следующие стадии:
– нейтрализацию гидролизата на анионите ЭДЭ-10п в ОН’ форме;
– сорбцию свободных аминокислот на катионите КУ2х8 в Н+ форме;
– элюцию аминокислот с катионита раствором щелочи.
Результаты процесса нейтрализации кислотного гидролиза демонстрирует табл. 2.
Объем кислотного гидролизата, показанный в табл. 2, взят из расчета объема смолы в колонне и ее динамической обменной емкости. Показатель pH полученного нейтрализованного гидролизата соответствует расчетным данным.
Отношение аминного азота к аммиачному уменьшается в случае аминокислотного гидролиза, что свидетельствует о более высокой степени деструкции. При сернокислотном гидролизе это соотношение увеличивается, т.е. наблюдается более выгодное для сорбции аминокслот соотношение между аминным азотом, соответствующим концентрации аминокислот в растворе, и конкурирующим с ним в процессе сорбции аммонием. Полученные нейтральные растворы гидролизатов анализировали на содержание свободных аминокислот на аминоанализаторе LC-5001 фирмы «Биотроникс» (Германия) по стандартной программе [1, 2].
Результаты анализа приведены в табл. 3.
Из полученных данных видно, что H2S04 и НС1 по-разному гидролизуют белок. Общее количество свободных аминокислот при увеличении концентрации кислоты возрастает. В случае с 4 н НС1 также наблюдается незначительное уменьшение общего количества аминокислот с увеличением продолжительности гидролиза.
При гидролизе с помощью серной кислоты достигается более высокое содержание аспарагиновой кислоты, глицина, аланина.
При солянокислотном гидролизе эти показатели уменьшаются. Однако количество других аминокислот, таких как цистин, валин, метионин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин, пролин, увеличивается. Особенно это относится к метионину, цистину, валину, аргинину, лизину.
Таким образом, более сбалансированную смесь аминокислот дает гидролиз с помощью 6 н НС1 при 130 °С.
Данный состав практически не изменяется от 4 до 6 ч, но при этом можно заметить незначительное понижение концентрации отдельных аминокислот к 6-ти часам.
Учитывая все эти факторы, можно допустить, что время проведения гидролиза в течение 5 ч оптимально.
По нашему мнению, представляло интерес оценить количественное соотношение суммы свободных аминокислот и пептидной фракции. Для этого был использован упрощенный метод оценки: нейтральный гидролизат пропускали через колонну с катионитом КУ2х8 в Н+ форме и в фильтрате определяли сухой остаток (СВ) в г/л и аминный азот (NNH ) в г/л.
При определении среднего количества аминокислотных звеньев в пептиде нами были приняты две условные величины:
— средний грамм-эквивалент аминокислоты, полученный отношением суммы их молекулярных масс к их количеству. Он составляет 130;
— количество грамм-эквивалентов аминокислот
В том случае, если бы количество сухого остатка (СВ) соответствовало только сумме свободных аминокислот, а грамм-эквивалент аминного азота соответствовал количеству грамм-эквивалентов аминокислот в фильтрате, то получилось бы соотношение
Истинное соотношение этих величин, отличное от 1, должно показать количество аминокислотных звеньев, связанных вместе в пептиде, т.е. полноту гидролиза.
Результаты расчетов и показатели сорбции аминокислот приведены в табл. 4.
Литература
1. Астаурова ОБ., Мыслова Н.Л., Тимохина Е.А., Беларева А.В., Капитова О Н. // Прикладная биохимия и микробиоло
гия. 1991. Т. 27. № 5, с. 14-15.
2. Berdutina А. V. et al. Study of the process of acid hydrolysis of keratin-containing raw materials as a method for manutature of food additives. //Cong. proc. 43-rd YCOMST. 1997. 27 July – 1 Aug. 1997. Oakland. New Zealand, pp. 482—483.
3. Ivankin A.N., Nekludov A.D., Mosma G. Y Utilization of wheat wastes by hydrolytic method for production of biologically active substances for food. Medical and microbiological purposes // Cong. proc. 43-rd YCOMST. 1997. 27 July – 1 Aug. 1997. Oakland. New Zealand, pp. 500—501.
4. Иванкин А Н. Биологически активные вещества из жировой ткани. Автореф. дисс…д-ра хим. наук. М., 1998.
5. Неклюдов А.Д., Иванкин А Н., Баер НА., Бердутина А.В., Дубина В.И. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. № 3, с. 24-25.
6. Неклюдов А.Д., Новашин С.М. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. № 9, с. 24-25.
7. Опытко Л.Ф., Остенникова З.П., Ильюхина.Е.А. // Фармация. 1997. Т. 26. № 6.
8. Тимохина Е.А.. Люблинская Л.А., Бойцова С.Е. // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. № 23, с. 426-428.
